Věda a výzkum

Výzkumná skupina biochemie denitrifikačních bakterií

prof. RNDr. Igor Kučera, DrSc.

Vedoucí skupiny

Kontakt


Vzdělání

  • 1998 – profesor Biochemie, PřF MU
  • 1992 – docent Biochemie, PřF MU
    • Oxid dusnatý v denitrifikační dráze bakterie P. denitrificans
  • 1992 – DrSc., Československá akademie věd
    • Regulace denitrifikačních pochodů u bakterie P. denitrificans
  • 1979 – RNDr., PřF UJEP (MU)
    • Reakce katalysované alkoholdehydrogenasou v přítomnosti dvou substrátů a koenzymu - analytická aplikace a kinetika


Univerzitní aktivity

  • Člen Vědecké rady PřF MU
  • Garant doktorského studijního programu Biochemie
  • Člen Oborové rady a Oborové komise Biochemie

Oblasti výzkumu a používané metody

Denitrifikace je anaerobní respirační pochod uskutečňovaný mikroorganismy, které jsou schopny místo kyslíku využívat jako alternativní akceptory elektronů kyslíkaté sloučeniny dusíku. Při denitrifikaci jsou oxoanionty dusičnan a dusitan přeměňovány na didusík a v menší míře na oxid dusný, jenž působí jako účinný skleníkový plyn a narušuje ochrannou ozonovou vrstvu. My pracujeme s bakterií Paracoccus denitrificans jako s modelovým denitrifikujícím organismem. Tato bakterie normálně obývá ekosystémy jako půda, voda a čistírenské kaly. Aerobně rostoucí buňky mají respirační řetězec, blízce připomínající respirační řetězec mitochondrií přítomností respiračních komplexů I–IV a homologu ubichinonu s deseti izoprenovými zbytky v postranním řetězci (UQ-10). Protože není schopna fermentovat, bakterie získává za anaerobiózy energii denitrifikací. Vytváří čtyři enzymy (nitrátreduktasu, nitritreduktasu a reduktasy oxidu dusnatého a dusného), které katalyzují postupnou redukci běžně přítomného dusičnanu až na plynný didusík. V naší skupině studujeme dynamiku těchto pochodů a její změny po vystavení buněk různým vnějším faktorům, jako např. inhibičně působícím látkám nebo generátorům oxidačního stresu. K tomuto účelu nově zavádíme metodu monitorování rozpuštěných plynů a těkavých látek pomocí hmotnostní spektrometrie s membránovým vstupem (MIMS – membrane inlet mass spectrometry).

V poslední době se ukázalo, že v metabolismu studované bakterie mohou hrát úlohu jisté enzymy, které využívají jako kofaktoru flavinmononukleotid (FMN). Jejich obsah v buňce se zvyšuje např. při oxidačním stresu nebo při limitaci sulfátem. Izolované proteiny charakterizujeme pomocí enzymové kinetiky a vazebných studií; v několika případech se nám již podařilo stanovit jejich krystalovou strukturu. Měříme také hladiny mRNA a proteinů za různých fyziologických stavů a zkoumáme fenotypové projevy vyřazení (knockoutu) příslušných genů. Zabýváme se i možnostmi praktického využití bakteriálních flavoenzymů.

Hlavní zaměření

  • Distribuce toku elektronů v rozvětveném respiračním řetězci. Systém přenosu elektronů v cytoplazmatické membráně P. denitrificans končí u tří rozdílných oxidas uskutečňujících redukci kyslíku na vodu a u čtyř denitrifikačních enzymů katalyzujících následné reakce dusičnan -> dusitan -> oxid dusnatý -> oxid dusný -> didusík. Rádi bychom přispěli k objasnění složitého vzájemného působení mezi těmito enzymy, které je dáno kompeticí o společné donory elektronů a inhibičním působením oxidu dusnatého. Jednou z cest je použití specifických mutantů.

  • Význam rychlosti transportu dusičnanu do buněk. Dusičnan musí projít přes cytoplazmatickou membránu dříve, než interaguje s prvním enzymem denitrifikační dráhy. Tento přesun je zprostředkován specifickým přenašečem nitrátu a je často považován za krok limitující rychlost celého denitrifikačního pochodu. Tuto možností se v současnosti zabýváme s použitím kmenů vytvářejících výlučně membránově vázanou nitrátreduktasu orientovanou do cytoplazmy (Nar) nebo periplazmatický enzym (Nap) a inhibitorů nitrátového přenašeče.

  • Flavin-dependentní oxidoreduktasy FerA a FerB. P. denitrificans má dva rozpustné enzymy, FerA a FerB, jež jsou schopny redukovat množství komplexů trojmocného železa s využitím NADH. Oba proteiny interagují s flaviny, ale odlišným způsobem. FerA nezbytně vyžaduje flavin jako kosubstrát a může být proto klasifikován jako NADH:flavin oxidoreduktasa. Naproti tomu FerB obsahuje nekovalentně vázaný flavinový koenzym, který přenáší elektrony z NAD(P)H na různé akceptory jako chinony, komplexy Fe(III) nebo chroman. Nedávno se nám podařilo klonovat a exprimovat gen ferB, krystalizovat selenomethioninový derivát proteinu a určit jeho krystalovou strukturu. Získaná strukturní data umožní studie vztahů mezi strukturou a reaktivitou. Zvláštní úsilí bude věnováno objasnění úlohy FerA a FerB v buněčném metabolismu.

  • Odezva bakteriálního proteomu na změny růstových podmínek. V současnosti využíváme 2D elektroforézy a denzitometrie ke srovnání hladin proteinů v různých kmenech rostoucích za aerobních, semianaerobních a anaerobních podmínek. Jako součást tohoto výzkumu sledujeme vliv látek vyvolávajících oxidační stres s cílem detektovat a identifikovat zúčastněné proteiny a geny.

Členové skupiny

  • Postdoci: Mgr. Vojtěch Sedláček, Ph.D.
  • Doktorandi:  Mgr. Ivo Fukala, Mgr. Martin Kryl

  • Absolventi: doc. Mgr. Pavel Bouchal, Ph.D., Mgr. Martin Hubálek, Ph.D., doc. Mgr. Marek Koutný, Ph.D., Mgr. Michal Kuňák, Ph.D., Mgr. Jiří Mazoch, Ph.D., Mgr. Nikola Ptáčková, Ph.D., Mgr. Vladimír Rotrekl, Ph.D., Mgr. Vojtěch Sedláček, Ph.D., Mgr. Jiří Zouhar, Ph.D

Mezinárodní spolupráce

  • IKBM, Norwegian University of Life Sciences (NMBU) – prof. Åsa Helena Frostegård
  • Systems Biology Lab, Vrije Universiteit Amsterdam, Nizozemsko – dr. Rob van Spanning

Vybrané publikace

  • Sedláček V., Kučera I. Functional and mechanistic characterization of an atypical flavin reductase encoded by the pden_5119 gene in Paracoccus denitrificans. Molecular Microbiology. HOBOKEN: WILEY. 2019. doi:10.1111/mmi.14260

  • Sedláček V., Kučera I. Arginine 95 is important for recruiting superoxide to the active site of the FerB flavoenzyme of Paracoccus denitrificans. FEBS Letters. Wiley. 2019. doi:10.1002/1873-3468.13359

  • Kučera I., Sedláček V. An Enzymatic Method for Methanol Quantification in Methanol/Ethanol Mixtures with a Microtiter Plate Fluorometer. Food Analytical Methods. New York: Springer. 2017. doi:10.1007/s12161-016-0692-2

  • Sedláček V., Klumpler T., Marek J., Kučera I. Biochemical properties and crystal structure of the flavin reductase FerA from Paracoccus denitrificans. Microbiological Research. ELSEVIER GMBH, URBAN & FISCHER VERLAG. 2016. doi:10.1016/j.micres.2016.04.006

  • Pernikářová V., Sedláček V., Potěšil D., Procházková I., Zdráhal Z., Bouchal P., Kučera I. Proteomic responses to a methyl viologen-induced oxidative stress in the wild type and FerB mutant strains of Paracoccus denitrificans. Journal of Proteomics. ELSEVIER SCIENCE BV. 2015. doi:10.1016/j.jprot.2015.05.002

  • Sedláček V., Ptáčková N., Rejmontová P., Kučera I. The flavoprotein FerB of Paracoccus denitrificans binds to membranes, reduces ubiquinone and superoxide, and acts as in vivo antioxidant. FEBS Journal. WILEY-BLACKWELL. 2015. doi:10.1111/febs.13126

  • Sedláček V., Klumpler T., Marek J., Kučera I. The Structural and Functional Basis of Catalysis Mediated by NAD(P)H:acceptor Oxidoreductase (FerB) of Paracoccus denitrificans. PLOS ONE, Public Library of Science. 2014. doi:10.1371/journal.pone.0096262